十二、應用實例：
1.Analysis of Exenatide Variants艾塞那肽變體的分析(= Byetta®)
COLUMN:
PolySULFOETHYLA(3μm, 300Å two 100x4.6-mm columns in series)
2.Isolation of Glyco- & Phosphopeptides
via ERLIC*
通過ERLIC（靜電斥力親水色譜）分離糖質及磷酸肽
Example
1: ERLIC of HeLa Cell Lysate Tryptic Digest
HeLa細胞裂解液胰蛋白酶消解產物靜電斥力親水色譜分析（Hela細胞，有時音譯為海樂細胞，亦稱實驗用增殖表皮癌細胞）
ERLIC是不需要梯度洗脫的梯度色譜！等度分離多肽，核苷酸與氨基酸！在ERLIC色譜柱上蛋白磷酸肽經過胰蛋白酶消化作用具有高分辨率的分離。用于完整的蛋白質分析的混合床離子交換柱。這是一種用于復雜提取物的蛋白組學分析的潛在的重要工具。在這種色譜柱上幾乎所有的蛋白質都被保留。 1000 - Å孔徑確保了即使是大的蛋白質也會有很好的尖峰。
A
100x4.6-mm column of PolyWAX LP® (5-μm, 300-Å) was used (item# 104WX0503). Over
3000
unique
tryptic phosphopeptides were identified. Solvents through Fraction 20 were
volatile.
對超過3000獨特的胰蛋白酶磷酸化肽進行了鑒定。通過餾分20的溶劑是揮發性的。
Example 2: Isolation of tryptic phospho-and glycopeptides胰蛋白酶磷酸化和糖肽的分離
Column:
204WX0503 Flow rate: 1 ml/min. Detection: 214 nm
Gradient:
0-10’: 0%B; 10-35’: 0-30% B; 35-40’: 30-100%B; 40-50’: 100%B
MP
A: 10 mM Na-methylphosphonate, pH 2.0, with 70% ACN 鈉 - 甲基膦酸二乙酯
MP
B: 200 mM TEA-phosphate, pH 2.0, with 25% ACN TEA-磷酸酯
(data courtesy
of S.K. Sze, Nanyang Technol. Univ.)
3. Mixed-Bed Ion-Exchange of Proteins 蛋白的混床離子交換
With complex protein
mixtures like lysates or serum, some protein will elute in the void volume from
any single ion-exchange column. With a mixed-bed column, though, almost all
proteins are retained, per the following example (a yeast lysate with a NaCl gradient
in MES buffer, pH 6):
與裂解物或血清這類的復雜蛋白質混合在一起，某些蛋白質可以從任何單離子交換柱的空體積洗脫。然而用混床柱，下面每個例子里幾乎所有蛋白都被保留：
Serum Proteins on a Mixed-Bed Ion-Exchange
Column- gradient from 20-800 mM NH4OAc, pH 7 -混床離子交換柱上血紅蛋白的分離
4.PolySULFOETHYL A™色譜柱的應用舉例（單抗的強陽離子交換）
5.肽的陽離子交換
強陽離子交換材料(SCX)是專門為肽段的高效液相色譜(HPLC)而設計的。在pH值2.7-3.0的時候，多肽失去(-)離子而獲得(+)離子，因此PolySULFOETHYL
A™是一種多用途的替代反相(RPC)的材料,多肽的分離是通過電荷而非極性。對比其他的基于磺丙基團的SCX材料, PolySULFOETHYL A™有顯著的親水性。將和肽的疏水相互作用降低到小,具有高復蘇性以及更小的峰拖尾。生產力也很高,允許胰酶消化的弱堿性肽段有更好的保留和分離。離子交換的能力是類似的RPC柱容量的四倍。因而,離子交換應該是多步驟純化的第一步。PolySULFOETHYL A™適用于:
混合肽段的多維高效液相色譜法,如胰酶消化的蛋白質組學分析(包括iTRAQ®和ICAT®*反應和產品)。
l 從天然產物分離的肽段。
l 質量控制和凈化的合成肽。
l 選擇性的分離胰酶消化的硫化物-肽、磷酸肽以及C端片段。
l 消化的肽段圖譜(胰酶、V8、溴化氫等)
蛋白質也可以使用PolySULFOETHYL
A™柱；在PH3的情況下，保證能全部保留下來。比如通過親水相互作用模式使用PolySULFOETHYL A™柱分離肺表面蛋白。
多肽分析的標準材質是300-Å,
3 -或5-µm兩種可供選擇。200-Å的材料大約有25%的更大容量，以及更加適用于磷酸肽的分離和iTRAQ®反應混合物肽段的分離。對于蛋白質,使用1000-Å的材料或者3-µm的1500-Å的材料。
值得一提的是PolyCAT™色譜柱
PolyCAT™色譜柱是血紅蛋白分析的一個黃金標準，利用分子排阻方式分離像氨基酸一樣的小分子
， PCR產物-高效液相色譜法能夠替代凝膠 。
